Назад
Когда пациенту пересаживают почку, врачи тщательно отслеживают признаки отторжения несколькими способами, включая биопсию.
Однако эта процедура является инвазивной и может выявить проблемы только на поздней стадии. Исследователи сообщили в журнале ACS Analytical Chemistry, что разработали анализ на основе CRISPR, который может чувствительно и неинвазивно обнаружить биомаркер острого отторжения почки в моче. В будущем это может помочь диагностировать отторжение на ранних стадиях без биопсии.
Получатели трансплантата почки должны принимать иммунодепрессанты до конца жизни, чтобы их иммунная система не атаковала чужеродный орган. Однако отторжение почки все же может произойти, особенно в первые несколько месяцев после трансплантации, что известно как острое отторжение. Признаки этого явления включают повышение уровня креатинина в сыворотке крови и такие симптомы, как боль в почках и лихорадка. В настоящее время единственным способом окончательной диагностики является биопсия, но эта процедура может выявить проблему только на относительно поздней стадии.
Возможность чувствительно и неинвазивно диагностировать отторжение почки на ранней стадии позволит врачам быстрее начать прием антирецидивных препаратов. Ранее исследователи обнаружили, что высокий уровень цитокинового белка CXCL9 в моче пациентов, перенесших пересадку почки, является ранним признаком отторжения. Но существующий метод измерения CXCL9 (иммуноферментный анализ, или ELISA) не очень хорошо работает в моче, что ограничивает его чувствительность. Поэтому Джонатан Дордик и его коллеги хотели разработать более чувствительный метод неинвазивной диагностики острого отторжения почки по анализу мочи.
В основу метода обнаружения исследователи положили технологию редактирования генов CRISPR/Cas12a. В присутствии белка CXCL9 фермент CRISPR/Cas12a разрезает зонд, создавая флуоресцентный сигнал. Исследователи усилили флуоресцентный сигнал путем присоединения штрих-кода ДНК, который объединяет большое количество молекул CRISPR/Cas12a, а затем связывается с антителом, распознающим CXCL9. Важно отметить, что в отличие от других методов обнаружения на основе CRISPR, не требуется ПЦР-амплификация, что облегчает адаптацию метода к устройству, которое можно использовать в кабинете врача или даже дома у пациента.
При тестировании образцов мочи 11 пациентов, перенесших трансплантацию почки, новая система точно измерила уровень CXCL9, причем показатели были очень похожи на ИФА. Однако, поскольку иммуно-CRISPR система примерно в 7 раз более чувствительна, чем ИФА, она может быть способна обнаружить отторжение почечного трансплантата на очень ранней стадии, говорят исследователи.
Inseon Lee et al. Высокочувствительный иммуно-CRISPR анализ для выявления CXCL9 (аннотация).
Для обнаружения целевой ДНК или РНК с помощью CRISPR используется двойная функция, включающая распознавание целевой последовательности с последующим транс-расщеплением сопутствующего линкера ssDNA между флуорофором (F) и гасителем (Q), который усиливает флуоресцентный сигнал при расщеплении. В данной работе мы расширили такую двойную функциональность в модифицированном формате иммуноанализа для обнаружения целевого белка CXCL9, уровень которого заметно повышен в моче реципиентов почечного трансплантата, переживающих эпизоды острого отторжения. Для создания "иммуно-CRISPR" анализа мы использовали конъюгаты анти-CXCL9 антитело-ДНК-штрих-код для нацеливания CXCL9 и усиления флуоресцентных сигналов посредством транс-расщепления репортерных субстратов FQ на основе Cas12a, соответственно, и в отсутствие изотермического этапа усиления.
Для повышения чувствительности обнаружения система ДНК-штрихкодов была сконструирована путем введения нескольких сайтов распознавания Cas12a. Использование биотинилированных ДНК-штрихкодов позволило осуществить самосборку на стрептавидине (SA) для создания комплексов SA-DNA-штрихкод для увеличения количества и плотности сайтов распознавания Cas12a, прикрепленных к биотинилированному анти-CXCL9 антителу. В результате мы повысили скорость обнаружения CXCL9 примерно в 8 раз по сравнению с использованием мономерного ДНК-штрихкода. Предел обнаружения (LOD) для CXCL9 с помощью иммуно-CRISPR анализа составил 14 пг/мл, что представляет собой ∼7-кратное улучшение по сравнению с традиционным ИФА на основе HRP. Селективность была продемонстрирована отсутствием перекрестной реактивности с родственным хемокином CXCL1. Наконец, мы успешно оценили присутствие CXCL9 в образцах мочи 11 реципиентов почечного трансплантата с помощью иммуно-CRISPR анализа, что дало 100% точность клинического определения CXCL9 и открыло путь для использования в качестве неинвазивного биомаркера для выявления отторжения почечного трансплантата.
