Назад
До сих пор использование моделей для исследования гематоэнцефалического барьера было либо ограниченным, либо чрезвычайно сложным.
Недавно исследователи разработали более реалистичную модель, которая также может быть использована для более эффективного изучения новых методов лечения опухолей мозга. Если бы Марио Модена, специалист лаборатории биоинженерии в ETH Zurich, объяснял свои исследования гематоэнцефалического барьера ребенку, он бы сказал: "Этот барьер очень важен, потому что он не дает плохим парням проникнуть в мозг. Если мозг поврежден или болен в барьере могут появиться отверстия. Иногда такие отверстия могут быть полезны, например, для снабжения мозга срочно необходимыми лекарствами. Поэтому мы пытаемся понять, как сохранить этот барьер, проникнуть сквозь него или восстановить его".
Это важно с медицинской точки зрения, поскольку многие заболевания центральной нервной системы связаны с повреждением гематоэнцефалического барьера. Чтобы узнать, как работает этот барьер, ученые часто проводят эксперименты на живых животных. Помимо того, что такие эксперименты относительно дороги, клетки животных могут дать лишь часть картины того, что происходит в организме человека. Более того, есть критики, которые ставят под сомнение обоснованность испытаний на животных. Альтернативой является проведение экспериментов на человеческих клетках, выращенных в лаборатории.
Проблема многих in vitro моделей заключается в том, что они воссоздают гематоэнцефалический барьер относительно упрощенным способом, используя эндотелиальные клетки. Такой подход не отражает сложную структуру человеческого организма и не учитывает, например, коммуникации между различными типами клеток. Кроме того, многие из этих моделей статичны. Другими словами, клетки плавают в суспензии, которая не движется, что означает, что не учитывается поток жидкости или напряжение сдвига, которому подвергаются реальные клетки.
Существуют также динамические модели in vitro, которые имитируют условия потока в организме, но проблема в том, что требуемые для них насосы делают экспериментальную установку довольно сложной. Наряду со всеми этими трудностями существует проблема измерения: практически невозможно получить изображения высокого разрешения структурных изменений гематоэнцефалического барьера в режиме реального времени и одновременно измерить электрическое сопротивление барьера, которое отражает компактность и герметичность барьера.
Модена и его коллеги потратили три с половиной года на разработку открытой микрофлюидной 3D-модели гематоэнцефалического барьера. Для воссоздания барьера исследовательская группа взяла те типы клеток, которые естественным образом образуют гематоэнцефалический барьер - эндотелиальные клетки микрососудов, астроциты и перициты человека - и объединила их в рамках одной платформы.
"Эта стратегия позволила нам почти полностью воспроизвести трехмерную клеточную структуру человеческого тела", - рассказывает Модена. "Но что действительно является уникальным, так это то, что мы можем измерять проницаемость барьера и одновременно отслеживать морфологические изменения барьера с помощью микроскопии высокого разрешения". Чтобы облегчить это двойное действие, исследователи поместили абсолютно прозрачные электроды на стеклянные покровные стекла с обеих сторон барьера для измерения его проницаемости, которая отражается в электрическом сопротивлении клеточного барьера. Прозрачные электроды имеют решающее преимущество перед другими типами электродов, к которым относятся металлические пленки или проволочные структуры, которые могут мешать оптическому обнаружению и микроскопии высокого разрешения.
Чтобы имитировать движение жидкости в организме, исследователи установили микрофлюидную платформу с резервуарами для жидкости на своеобразные качели. Гравитация вызывала поток, который, в свою очередь, создавал силу клеточного сдвига. Модена объясняет преимущество такой модели: "Поскольку мы не используем никаких насосов, мы можем экспериментировать с несколькими модельными системами одновременно без увеличения сложности".
В исследовании, опубликованном недавно в журнале Advanced Science, исследователи представили и протестировали свою новую модель гематоэнцефалического барьера in vitro. Они подвергли барьер кислородно-глюкозному голоданию, как это происходит при инсульте. "Эти эксперименты позволили нам вызвать быстрые изменения в барьере и продемонстрировать потенциал платформы", - поясняет Модена.
В ходе этого исследования Модена и его коллеги смогли не только показать, что их новая платформа подходит для проведения измерений. Они также обнаружили, что электрическое сопротивление барьера снижается еще до того, как он претерпевает морфологические изменения, которые делают его более проницаемым. "Этот вывод может оказаться важным для будущих исследований", - отмечает Модена. Авторы также обнаружили, что в контрольных экспериментах с использованием статической модели in vitro барьер был более проницаемым, чем в новой динамической установке. "Очевидно, что сила сдвига, создаваемая гравитационным потоком, способствует образованию более плотного барьерного слоя, что подтверждает важность потока для репрезентативных in vitro моделей", - утверждает Модена.
Авторы считают, что их модель позволит легче определить, какие молекулы стабилизируют барьер, а также обнаружить соединения и методы, подходящие для его преодоления, что было бы полезно при лечении опухолей мозга. Но Хирлеманн отмечает, что модель также может изменить ход будущих исследований in vitro: "Преимущество нашей платформы в том, что ее очень легко адаптировать к другим моделям эндотелиальных клеток, где сочетание измерения герметичности барьера и микроскопии высокого разрешения может проложить путь для новых исследований". Производители уже проявили интерес к новой модели и одна фармацевтическая компания уже поддерживает контакт с исследователями.
Wei Wei et al. 3D in vitro модель гематоэнцефалического барьера для исследования повреждений барьера при инсультах (аннотация).
Нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) связано с различными заболеваниями центральной нервной системы. Модели ГЭБ in vitro позволяют исследовать, как барьер реагирует на внешние повреждения, обычно называемые инсультом.
В данном исследовании представлена платформа ГЭБ на основе человеческих клеток с интегрированными прозрачными электродами для мониторинга герметичности барьера в режиме реального времени с высоким разрешением. Модель ГЭБ объединила эндотелиальные клетки головного мозга человека, первичные перициты и астроциты в трехмерном расположении в открытой микрофлюидной платформе без насоса. С помощью этой платформы в данном исследовании продемонстрировано, что кислородно-глюкозное голодание (OGD), которое имитирует характеристики ишемического инсульта, вызывает быстрое ремоделирование клеточных актиновых структур и последующие морфологические изменения в эндотелиальных клетках. Живая визуализация высокого разрешения показывает формирование больших пучков актиновых волокон в эндотелиальном слое во время применения OGD, что в конечном итоге приводит к сокращению клеток и разрушению барьера. Одновременные электрические измерения продемонстрировали быстрое снижение электрического сопротивления барьера до появления стрессовых волокон, что свидетельствует о нарушении барьерной функции еще до появления резких морфологических изменений.
Результаты показывают, что платформа ГЭБ повторяет основные барьерные функции in vitro и может быть использована для изучения быстрой реорганизации ГЭБ при воздействии внешних стимулов.
